PUREfrex^®是基于PURE system开发的重组无细胞蛋白合成试剂盒。PURE system是东京大学的上田卓业教授团队开发的重组无细胞蛋白合成系统，是将转录、翻译和能量回收所需的蛋白和核糖体单独纯化，然后与氨基酸、NTP等混合的合成系统。通过添加编码目标蛋白的DNA或mRNA至反应液中进行反应来合成蛋白。由于使用了组分经纯化的混合反应液，因此具有可自由调整其组成，且几乎不含与翻译等无关的蛋白的优点。

PUREfrex^® 2.1保留PUREfrex^® 2.0反应液组分的同时，对Solution Ⅰ进行细分，并提供还原剂，可根据需求选择更合适的蛋白合成条件。

特别推荐用于需严格控制氧化还原条件的含二硫键蛋白的合成。可搭配添加剂DsbC Set (#PF005-0.5)或PDI Set（#PF006-0.5）使用。

PUREfrex^® 2.1不含分子伴侣，因此根据合成蛋白不同，可能无法形成正确的高阶结构，也可能无法溶解。这时，只需在蛋白合成时添加分子伴侣即可解决。GeneFrontier也推出了适用于本试剂盒的分子伴侣DnaK mix（#PF003-0.5）和GroE mix（#PF004-0.5）。

◆使用示例

需要二硫键结合的蛋白合成

使用不同种类的还原剂合成两种蛋白，并比较其合成量和活性。结果显示，虽然合成量无差异，但二硫键的形成效率不同。

1. IgG的合成

IgG是通过二硫键（SS键）形成2条L链（轻链）和2条H链（重链）的四聚体结构。向含GSSG（氧化型谷胱甘肽）、大肠杆菌的二硫键异构酶DsbC和加入了分子伴侣的PUREfrex^®反应液中添加不同种类的还原剂合成IgG，并比较其合成量。结果显示，虽然从SDS-PAGE的电泳分析中没有发现L链和H链合成量的显著差异，但四聚体结构的IgG形成效率根据使用的还原剂种类各异。

使用试剂盒

● PUREfrex^® 2.1（#PF213-0.25）

DTT、GSH

● DsbC Set（#PF005-0.5）
GSSG、DsbC

● DnaK Mix（#PF003-0.5）
DnaK、DnaJ、GrpE

2. 酸性磷酸酶（AppA）活性

使用两种还原剂DTT和GSH（还原型谷胱甘肽），并添加改变浓度的GSSG（氧化型谷胱甘肽）和大肠杆菌的二硫键异构酶DsbC合成需要二硫键（SS键）的大肠杆菌AppA^*1，并比较其合成量和活性。结果显示，虽然从还原凝胶的电泳分析中没有发现AppA的合成量有显著差异，但根据使用的还原剂类型和浓度，合成的AppA的活性会有所不同。

使用试剂盒

● PUREfrex^® 2.1（#PF213-0.25）
DTT、GSH

● DsbC Set（#PF005-0.5）
GSSG、DsbC

*1） AppA有5个二硫键，其中一个为半胱氨酸残基间的二硫键。

◆产品组成

关于PUREfrex^® 2.1中各Solution成分保密。

250 µL反应用

2 mL反应用

*1）试剂盒开封前，请在-80℃条件下储存。

*2）SolutionⅠ中不含半胱氨酸和还原剂。蛋白合成时，请根据需要添加试剂盒附带的半胱氨酸和还原剂。

*3）在-80°C条件下储存使用后的剩余反应溶液时，应在储存前使用液氮或干冰/乙醇等进行速冻。请根据需求进行分装，避免反复冻融。

*4）当用作蛋白合成的阳性对照时，请在20 µL合成反应溶液中添加1 µL DHFR DNA。

◆使用方法

使用PUREfrex^® 2.1时，可在任意体积的反应液下进行蛋白合成。例如，在20 μL反应液中添加0.5 mM半胱氨酸和4 mM GSH进行合成时，反应液的制备方法如下所示。添加形成二硫键（SS键）所需的添加剂DsbC Set（#PF005-0.5）或PDI Set（#PF006-0.5）进行合成时，请查看各产品的详情页。

1. 将SolutionⅠ、Cysteine、GSH在室温~37℃下加热1 min左右至完全融解，随后置于冰上。

2. 将Solution Ⅱ和Solution Ⅲ置于冰上融解。

3. 将融解的SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ、Cysteine、GSH轻轻涡旋后，离心并收集试管底部的内容物。

4. 根据下述配比制备反应液。（DNA添加量为每kbp 0.5-3 ng/μL）

5．在37°C的加热块或水浴中反应2~6 h，合成蛋白^注3。

6．合成的蛋白可用于多种用途^注4。

注意事项

注1）请注意，使用量与PUREfrex^® 2.0不同。

注2）模板DNA请根据目标蛋白自行制备。关于制备方法，请联系富士胶片和光客服。

注3）如果在气相恒温槽（如培养用恒温器）中进行反应，反应液的温度上升需花费更多的时间，合成量会有所降低。

注4）通过SDS-PAGE确认合成时，请用水稀释反应液后进行电泳。详情请联系富士胶片和光客服。

◆使用注意事项

PUREfrex^® 为研究用试剂，不可用于包含人在内的动物给药、临床和诊断等其他用途。此外，请勿用于食品或家庭用途。使用PUREfrex^® 时，请使用不含RNase的水、试剂和设备。此外，建议佩戴手套和口罩。

◆产品列表

＊若需要更小规格的分装，请咨询富士胶片和光客服

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