ClearSee™是一种仅需固定、洗净、透明化三步简单操作便可使植物组织透明化的试剂。作为植物科学的新技术,ClearSee™ 通过结合现有的荧光蛋白和荧光色素的成像技术,有望用于阐明细胞水平的现象与固态整体之间的连接系统。
◆拟南芥叶透明化
※ 详细方法请参考产品使用说明书
使用ClearSee™ 进行透明化需要的物品
1. 高压灭菌锅

2. 局部排气系统(通风室等)

3. 真空泵
4. 干燥机
5. 60°C 恒温器
6. 荧光显微镜
7. 锥形管
8. 微量离心管
9. 封口膜
10. 针
11. 镊子
12. 盖玻片
13. 载玻片
14. 凡士林油
注意
※ 由于植物活体样本含有空气,添加溶液时植物就会漂浮起来。请尽可能地将植物样本浸入固定液中。
※ 请将干燥机设定在-90 kPa左右。根据植物样本的不同,有时减压会过强。减压过强的话,会破坏植物组织和细胞。开始减压后,由于会抽出植
※ 物样本中的空气,会产生气泡。为了让气泡消失,请缓慢调整减压的压强。
※ 从减压状态恢复至大气压强时,请缓慢进行。如果急速恢复至大气压强的话,会破坏植物组织和细胞。
※ 透明化的时间根据植物种类和组织而异,请参照以下的时间。
    根:1~2天、叶和幼株:4~7天、雌蕊:2周、成熟组织:4周。
◆观察案例
在载玻片上用凡士林或油脂制作一个围栏,放入适量 ClearSee™,用镊子将样本移入,盖好盖玻片,并用荧光显微镜观察。由于 ClearSee™干燥后会产生沉淀,所以用凡士林或油脂来防止其干燥。观察结束后,可以将植物样本放回装有 ClearSee™ 的微管中进行保存。
另外,用 ClearSee™ 透明化的样本亦可用荧光色素进行染色。细胞核染色时,向 ClearSee™ 中添加终浓度为 10 μg/ mL 的双苯甲酰亚胺 H33258 三盐酸盐,双苯甲亚胺 H33342 或 DAPI,细胞壁染色时,使用终浓度为 1 mg/mL,静置1 h后,更换新的 ClearSee™ ,再静置1 h后,在荧光显微镜下进行观察。
图1. 经透明化处理的拟南芥叶在明场中呈透明状态,叶绿素的红色自发荧光消失
由于可以对整片叶进行观察,因此也可以观察到维管束内的荧光蛋白。比例尺为 200 μm。
图2. 使用 ClearSee™ 透明化的完整的雌蕊的荧光观察
用4个颜色(蓝色,绿色,黄色,红色)的荧光蛋白标记花粉管。根据参考文献改编转载。
图3. 使用 ClearSee™ 处理4天的拟南芥的根
生长素应答细胞的细胞核用绿色、全身的细胞核用紫色显示。根据参考文献改编转载。
■ 其他植物的透明化案例

使用 ClearSee™ 透明化6天后的蓝猪耳、矮牵牛、烟草、番茄、黄瓜、稻叶。

稻叶在透明化时,由于叶子的表面有蜡层,因此很难将溶液渗入组织里,通过在氯仿等有机溶剂中浸泡 10~30 秒除蜡后,开始固定的步骤。
图4. 使用 ClearSee™ 透明化的各种植物叶片(6天后)
◆参考文献
Kurihara, D. et al.: Development142, 4168-4179 (2015).
◆产品列表
※ 仅供实验研究用,不可用于临床诊断。

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